PCR反應的(de)最大(dà)特點是(shì)→®♠具有(yǒu)較大(dà)擴增能(néng)力與極高(gāo)的(d¥δe)靈敏性，但(dàn)令人(rén)頭痛的(de)問(wèn)題是±&≠(shì)易污染，極其微(wēi)量的(de)污 ™染即可(kě)造成假陽性的(de)産生(shēng)。

1、标本間(jiān)交叉污染：

标本污染主要(yào)有(yǒu)收集标本的(d↕↓$e)容器(qì)被污染，或标本放(fàng)置時(shí)≠±，由于密封不(bù)嚴溢于容器(qì)外(wài)，或容器≤"(qì)外(wài)粘有(yǒu)标本而造成相(xiàng)互間•'€(jiān)交叉污染；标本核酸模闆在提取過程中，由✔↔于吸樣槍污染導緻标本間(jiān)污染；有(yǒu)些∞♣(xiē)微(wēi)生(shēng)物(wù)标本尤其是(shì)病←§毒可(kě)随氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導緻彼此間(<£​jiān)的(de)污染。

2、PCR試劑的(de)污染：

主要(yào)是(shì)由于在PCR試劑配制(zε¶​hì)過程中，由于加樣槍、容器(qì)、雙蒸水(s•≈huǐ)及其它溶液被PCR核酸模闆污染。

3、PCR擴增産物(wù)污染：

這(zhè)是(shì)PCR反應中最主要(yào)最常見(jiàn>₹)的(de)污染問(wèn)題，因為(wèi)PCR産物(wù)拷貝♥∞‌÷量大(dà)(一(yī)般為(wèi)10α™✘13拷貝/mL)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高(★≠gāo)于PCR檢測數(shù)個(gè)拷貝的(de)極限，所以←δλ極微(wēi)量的(de)PCR産物(wù)污染，就(jiù)可(kě)造成♠→₩假陽性。 

還(hái)有(yǒu)一(yī)種容易忽¶€≥視(shì)，最可(kě)能(néng)造成↓™₹βPCR産物(wù)污染的(de)形式是(shì)氣溶膠污染；在空( >'<kōng)氣與液體(tǐ)面摩擦時(shí)就(jiù♥‍&β)可(kě)形成氣溶膠，在操作(zuò)時(sh$ í)比較劇(jù)烈地(dì)搖動反應管，開(kāi)蓋時♣£(shí)、吸樣時(shí)及污染進樣槍的(d±<e)反複吸樣都(dōu)可(kě)形成氣溶膠而污染。據計(jì)算(suπ£•àn)一(yī)個(gè)氣溶膠顆粒可(kě)¥$含48000拷貝，因而由其造成的(de)污染是(shì)一(yī)π∏✘₽個(gè)值得(de)特别重視(shì)的(de)問(wèn)題。

4、實驗室中克隆質粒的(de)污染：

在分(fēn)子(zǐ)生(shēng)物(wù)學實驗δ>室及某些(xiē)用(yòng)克隆質粒做(zuò)陽性對(duì)照(  Ω≈zhào)的(de)檢驗室，這(zhè)個(gè)問(w<∞èn)題也(yě)比較常見(jiàn)。因為(wèi)克隆質粒在• ≥單位容積內(nèi)含量相(xiàng)當高(gππāo)，另外(wài)在純化(huà)過₩∏ 程中需用(yòng)較多(duō)的(de)用(yòng)具∞π>及試劑，而且在活細胞內(nèi)的(de)質σ↔♦♦粒，由于活細胞的(de)生(shēng)長(cháng)繁殖的(™$↕de)簡便性及具有(yǒu)很(hěn)強的(de)生(shēng)命力‌©，其污染可(kě)能(néng)性也(yě)很(hě₽↔n)大(dà)。  

5、對(duì)照(zhào)試驗 

a、陽性對(duì)照(zhào)：在建立PCR反應實驗₹₽£♦室及一(yī)般的(de)檢驗單位都(dōu)應設有(yǒu)PCR♠→陽性對(duì)照(zhào)，它是(shìπλφ•)PCR反應是(shì)否成功、産物(wù)條帶→✔≠®位置及大(dà)小(xiǎo)是(shì)否合®≠✘乎理(lǐ)論要(yào)求的(de)一(yī)✘★個(gè)重要(yào)的(de)參考标志(zhì)。§₹♠←陽性對(duì)照(zhào)要(yào)選擇擴增度中等、重複←₽性好(hǎo)，經各種鑒定是(shì)該産物 "₹‌(wù)的(de)标本，如(rú)以重組質粒為(wèi)陽性 ₽♥對(duì)照(zhào)，其含量宜低(d™€≥ī)不(bù)宜高(gāo)(100以下(xià)個(gè)拷貝)，但(dà✘®n)陽性對(duì)照(zhào)尤其是(shì)重組質粒"βε"及高(gāo)濃度陽性标本，其對(duì)檢測或擴增樣品污染的(d✘∏↔e)可(kě)能(néng)性很(hěn)大(dà)。因而當某一(÷£yī)PCR試劑經自(zì)己使用(yòng)穩定，檢±β•¥驗人(rén)員(yuán)心中有(yǒu)數(shù)時(shí)，÷♠在以後的(de)實驗中可(kě)免設陽性對(duì<>₽)照(zhào)。

b、陰性對(duì)照(zhào)：每次PCR實驗≠☆ 務必做(zuò)陰性對(duì)照(zhào)。它包括①标本對(d‍€↑uì)照(zhào)：被檢的(de)标本是(↓δ‌shì)血清就(jiù)用(yòng)鑒ε♣≥≠定後的(de)正常血清作(zuò)對(duì)照(zhào)；被εα★∏檢的(de)标本是(shì)組織細胞就(jiù)用(yòng)相(xi∑↑£àng)應的(de)組織細胞作(zuò)對(duì)照(z₽$≥≥hào)。②試劑對(duì)照(zhào)：在≈§₹≥PCR試劑中不(bù)加模闆DNA或RNA，進行₹β(xíng)PCR擴增，以監測試劑是(shì)否污染。

1、合理(lǐ)分(fēn)隔實驗室：将樣品的(d✔ e)處理(lǐ)、配制(zhì)PCR反應液、PCR循環擴增及Pβ ‍CR産物(wù)的(de)鑒定等步驟分(fπε&εēn)區(qū)或分(fēn)室進行(xí€♥≤₹ng)，特别注意樣本處理(lǐ)及産物(wù)的(de)鑒定等<€步驟分(fēn)區(qū)或分(fēn)室進行(∑×xíng)，及PCR産物(wù)的(de)鑒定應與其它步驟嚴§ ♦£格分(fēn)開(kāi)。 

最好(hǎo)能(néng)劃分(fēn)①标本處理(lǐ)區(q↓σ‌✘ū)；②PCR反應液制(zhì)備區(qū)；③PCR循環擴增區€←≥×(qū)；④PCR産物(wù)鑒定區(qū)。₩↓γ其實驗用(yòng)品及吸樣槍應專用(yòngφφ✘±)，實驗前應将實驗室用(yòng)紫外(wài)線消毒以破壞εγ殘留的(de)DNA或RNA。

2、吸樣槍：吸樣槍污染是(shì)一(yī)個(gè)值得(dλ↑≈e)注意的(de)問(wèn)題。由于操作(zuò)時(s∞€hí)不(bù)慎将樣品或模闆核酸吸入槍內(nèi)或粘上(shàα↑ng)槍頭是(shì)一(yī)個(gè)嚴重的→↑(de)污染源，因而加樣或吸取模闆核酸時(s♠×hí)要(yào)十分(fēn)小(xiǎo)心，吸樣要(λα±yào)慢(màn)，吸樣時(shí)盡量一(yī)次性完成，忌多(d¥§↔≤uō)次抽吸，以免交叉污染或産生(shēng δσ)氣溶膠污染。

3、預混和(hé)分(fēn)裝PCR試劑：所有(yǒu)的(de)PCR試劑≠Ω€"都(dōu)應小(xiǎo)量分(fēn)裝 ←✘σ，如(rú)有(yǒu)可(kě)能(néng)，PCR反應液應預先配制(≠πzhì)好(hǎo)，然後小(xiǎo)量分(fēn)裝，-20℃保存©♦。以減少(shǎo)重複加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會(huì)。↕£另外(wài)，PCR試劑，PCR反應液應與樣品<∑及PCR産物(wù)分(fēn)開(kāi)保存，不(bù)應& 放(fàng)于同一(yī)冰盒或同一(yī)冰箱。 

4、防止操作(zuò)人(rén)員(yuán×←§)污染，使用(yòng)一(yī)次性手套、吸頭、小(xγ ¶✘iǎo)離(lí)心管應一(yī)次性使用(yòng)。

5、設立适當的(de)陽性對(duì)照(zhào<€∑)和(hé)陰性對(duì)照(zhào)，φ♣✘陽性對(duì)照(zhào)以能(né↓§ng)出現(xiàn)擴增條帶的(de)₽☆∏最低(dī)量的(de)标準病原體(tǐ)核酸為(wèi)宜，并§✔注意交叉污染的(de)可(kě)能(néng)性，每次反應都(dōu)應有( ♣↔yǒu)一(yī)管不(bù)加模闆的(de)試劑φ≥對(duì)照(zhào)及相(xiàng)應不(bù)含★₩∞ 有(yǒu)被擴增核酸的(de)樣品作(zuò)陰性對(duì)照(←♠ε​zhào)。

6、減少(shǎo)PCR循環次數(shù)，隻要(♦₩¶€yào)PCR産物(wù)達到(dào)檢測水(sh ≈§uǐ)平就(jiù)适可(kě)而止。

7、選擇質量好(hǎo)的(de)Eppen£•♦∞dorf管，以避免樣本外(wài)溢及外(wài)來(lái)核酸的(≠↓de)進入，打開(kāi)離(lí)心管前應先離(lí)心，将管壁及管蓋上(s↑♥hàng)的(de)液體(tǐ)甩至管底部。開↕>(kāi)管動作(zuò)要(yào)輕，→¥<以防管內(nèi)液體(tǐ)濺出。