脂肪酸氣相(xiàng)色譜分(fēn)析$π✘的(de)故事(shì)

2015-07-17 作(zuò)者：浏覽數(shù)：2026

編者注：傅若農(nóng)教授生(shēng)于19§β30年(nián)，1953年(nián)畢業(φ₹™‌yè)于北(běi)京大(dà)學化(huà)學系，而後一(yī)直在北←₹(běi)京理(lǐ)工(gōng)大(dà)學(原北(b‌βěi)京工(gōng)業(yè)學院)從(cóng)事(s∑§hì)教學與科(kē)研工(gōng)作(zuò)。1958年(nián)，γ傅若農(nóng)教授開(kāi)始帶領學生(s↔≠★♥hēng)初步進入吸附柱色譜和(hé)氣相(xiàng)色譜的★€≤≤(de)探索;1966到(dào)1976年÷φ(nián)文(wén)化(huà)大(dà)革命的₽>π♠(de)後期，傅若農(nóng)教授在幹校(xiàoε<$∑)勞動的(de)間(jiān)隙，系統地(dì)閱讀( "dú)并翻譯了(le)兩本氣相(xiàng)色譜啓蒙書(shū)，從(cóng↓"β↑)此進入其後半生(shēng)一(yī)直從(cóng÷δ÷§)事(shì)的(de)事(shì)業(yè)—&m←₽∏βdash;色譜研究。傅若農(nóng)教授是(shì)我國(guó)老(↔α×‌lǎo)一(yī)輩色譜研究專家(jiā)，見(jiànα✘↓♥)證了(le)我國(guó)氣相(xiàng)色譜研究的(®÷≤§de)發展，為(wèi)我國(guó)培養了(le)衆®↔→多(duō)色譜研究人(rén)才。

第一(yī)講：傅若農(nóng)講述氣相 '♦(xiàng)色譜技(jì)術(shù)發展曆史及趨勢

第二講：傅若農(nóng)：從(cóng)三家(jiā)公司GC産品更叠看↔£‍₩(kàn)氣相(xiàng)技(jì)術(shù)£←ε發展

第三講：傅若農(nóng)：從(cóng)國(guó)産氣≠‌相(xiàng)産品看(kàn)國(guó)內(nèi)氣相(xiàn•g)發展脈絡及現(xiàn)狀

第四講：傅若農(nóng)：氣相(xià←§ng)色譜固定液的(de)前世今生(shēng)

第五講：傅若農(nóng)：氣-固色譜的(₩σde)魅力

第六講：傅若農(nóng)：PLOT氣相(xiàng)色譜柱的(de)誘惑≠δ&λ力

第七講：傅若農(nóng)：酒駕判官——頂空(k ↑ōng)氣相(xiàng)色譜的(de)¥δ™₹前世今生(shēng)

第八講：傅若農(nóng)：一(yī)掃而光(guāng)&mdash¶✘β♠;—吹掃捕集-氣相(xiàng)色譜的(de)發展

第九講：傅若農(nóng)：淩空(kōng)一(yī)瞥洞察一(yī) ♣切——神通(tōng)廣大™∞(dà)的(de)固相(xiàng)微(wēi)萃取（ &×≠SPME）

第十講：傅若農(nóng)：懸“珠&rdqu®<o;濟世——單液滴微(wēi)萃取(SDME)的₹(de)妙用(yòng)

第十一(yī)講：傅若農(nóng)：扭轉乾坤<→©®——神奇的(de)反應頂空(kōng)氣相(xiàng≥✔)色譜分(fēn)析

第十二講：擒魔序曲——脂質組學研究中的(de✘ε)樣品處理(lǐ)

第十三講：離(lí)子(zǐ)液體(tǐ)柱—&×÷∞mdash;脂質組學中分(fēn)離(lí)→$♥脂肪酸的(de)氣相(xiàng)色譜柱

上(shà✔₽ng)一(yī)講我們主要(yào)介紹了(le)在脂質組學中對(duε∏™≈ì)脂肪酸的(de)分(fēn)析所用(yòng)的(de☆ )離(lí)子(zǐ)液體(tǐ)毛細管色譜柱，但(dàn‍δ)是(shì)用(yòng)氣相(xiàng)色譜♣$≤分(fēn)析脂肪酸源遠(yuǎn)流長(cháng)，有(yǒu)許多(dΩ"λ₽uō)故事(shì)，了(le)解一(yī)些(xiē™ $₽)過去(qù)的(de)故事(shì)對♠$™ (duì)現(xiàn)在的(de)發展理(lǐ)解有(yǒu)好(hǎo)< 處，溫故才可(kě)以知(zhī)新。

　　先講一(yī)下(xià)脂質組學中常常要₹¥≈(yào)研究的(de)血漿分(fēn)析×γλ¥，其中一(yī)個(gè)重要(yào)的(de)項目是(♣απβshì)分(fēn)析其中的(de)脂肪酸，®β✘"下(xià)面一(yī)個(gè)例子(zǐ)，概要(yào)σ♣•介紹了(le)血漿中脂肪酸的(de)主要(y$≈ào)成分(fēn)：

　　“雖然遊離(lí)脂肪酸隻占₽₩'血漿中脂肪酸的(de)一(yī)小(xiǎo)部分(fēn)，但(dàn÷δ∑↑)它代表一(yī)類高(gāo)度代謝(xiè)活性的(de)脂質♠¥，脂肪組織是(shì)血漿遊離(lí)脂肪酸的(de)主 ✔€要(yào)來(lái)源，其分(fēn)÷←σΩ布與食物(wù)的(de)脂肪酸組成密切相(xiàng)關。在正常≈‌情況下(xià)從(cóng)脂肪組織中釋放(fàng)脂肪酸與組織φγγ對(duì)能(néng)量的(de)需要(yào)緊密相₩↓(xiàng)連。但(dàn)是(shì)當代謝(↓♥$₽xiè)失調時(shí)，這(zhè)種平衡被打亂，導緻脂解增加，會(hu✔←ì)釋放(fàng)出多(duō)于組織所需要(yào)脂肪酸的(deε±¶↓)量。健康人(rén)經過一(yī)夜禁食後血漿中含有(π∏yǒu)214 nmol/ml遊離(lí)脂肪酸→♣，油酸(18:1)的(de)含量最高(gāo)，其次是(s§σ∑ hì)棕榈酸(16:0)和(hé)硬脂酸(18:0)，這(zhè)三種酸占&∑全部遊離(lí)脂肪酸的(de)78%。亞油酸(18:2)和(±φ¶hé)花(huā)生(shēng)四酸(20:↔π≈γ4) 是(shì)主要(yào)的(de)多(duō)不(b>↕'‌ù)飽和(hé)脂肪酸(約占8%)。但(dàn)是(shπ±§ì)有(yǒu)營養作(zuò)用(yòng)的(de≤≠‍")α-亞麻酸(18:3ω-3)，二十碳五β↑δ 烯酸(20:5, EPA)和(hé)二十二碳六烯酸(22:6, DHA)也 ←✘↑(yě)占有(yǒu)一(yī)定比例，約為(wèi)全部遊離(£® lí)脂肪酸的(de)1%。”

1 脂肪酸氣相(xiàng)色譜分(fēn)析的(de)曆史故事(shì)§≈

　　氣相(xiàng)色譜被認為(wèi)是(shì)分(fēn)析↑ §複雜(zá)混合物(wù)中脂肪酸的(de)可(kě)靠γ€方法，這(zhè)一(yī)方法可(kě)追述到(dào)上(sh✘"™λàng)世紀50年(nián)代，氣相(xδ•✘Ωiàng)色譜的(de)出現(xiàn)于脂肪酸的(de)分(fēnΩ•✔)析有(yǒu)密切的(de)關系，1952年(nián)氣相(xià÷∏ng)色譜發明(míng)人(rén)A. T. James 和★®(hé) A. J. P. Martin就(jiù)用(yòng)最為&∑(wèi)原始的(de)自(zì)制(zhε≠ì)氣相(xiàng)色譜儀分(fēn)析小(xδ≈ €iǎo)分(fēn)子(zǐ)脂肪酸(Bio®★chem J,1952,50:679),他(tā)•☆ε們首次闡明(míng)氣-液分(fēn)↓λ配氣相(xiàng)色譜的(de)原理(lǐ)，設'γ♦♠計(jì)了(le)自(zì)動滴定檢測脂肪酸的(d' αe)氣相(xiàng)色譜儀。實驗過程中使用(yòng)的(de)色譜₹×柱為(wèi)玻璃柱，其內(nèi)徑為(wèi)4±₹mm，長(cháng)度為(wèi)5英尺，固定相(xiàn€÷≈g)是(shì)把DC 550矽油塗漬在矽藻土(tǔ)Celit←€ e 545上(shàng)。分(fēn)離(lí)小(xiǎε♦ ≤o)分(fēn)子(zǐ)脂肪酸的(de)色δ∞★π譜如(rú)圖1所示。

圖1 用(yòng)自(zì)動滴定計(jì)氣相(xi¶àng)色譜儀分(fēn)析小(xiǎo)分(fēn)子(zǐ)脂肪↑←✔酸的(de)色譜圖

　　分(fēn)離(lí)從(cóng)乙酸到(dào)戊酸的(de‍∏÷£)色譜如(rú)圖2所示：

圖 2 分(fēn)離(lí)從(cóng)乙酸到(dào)戊酸的(φ↕de)色譜

　　此後分(fēn)析脂肪酸的(de)一(yī)個(gè)重大(dà)進 ☆步是(shì)把脂肪酸進行(xíng)甲酯化(h↔σuà)，1956年(nián)James和(hé)Martin使∑用(yòng)氣體(tǐ)密度檢測器(qì≠ )，并把脂肪酸進行(xíng)甲酯化(huà)，使用(yòng)阿皮松類高→♠☆↓(gāo)溫潤滑脂作(zuò)固定相(xià ∞ng)，可(kě)以分(fēn)離(lí)分(fēn)子(z©¶←ǐ)量大(dà)的(de)脂肪酸。圖3 是(sh≤•ì)分(fēn)離(lí)C5-C13直π₹鏈和(hé)支鏈脂肪酸甲酯的(de)色譜圖。

圖 3 用(yòng)高(gāo)沸點潤滑脂分(fēn)離(lí)C5-C1≠λ3直鏈和(hé)支鏈脂肪酸甲酯的(de)色譜圖

色譜柱：在矽藻土(tǔ)載體(tǐ)上(shàng)塗漬高(gāo)₹✘ 沸點潤滑脂；柱溫：197℃；載氣：氮氣 14.1mL/min;

色譜峰: (1) 空(kōng)氣, (2) n-戊酸甲酯δ♥，(3) n-己酸甲酯, (4) 4-甲基己酸甲酯,♣↕↓↑

(5) 6-甲基庚酸甲酯, (6) n-辛酸甲酯,÷≈>¥ (7) 6-甲基辛酸甲酯, (8) n-壬酸甲酯,

(9) 8-甲基壬酸酯, (10) n-癸酸酯, (11) 8-甲基癸酸酯,¶"₹ (12) 10-甲基十一(yī)酸酯&nb✔•sp; ,

（13) n-十二酸酯, (14) 10-甲基十二酸酯

2 脂肪酸氣相(xiàng)色譜分(fēn)析的(de)發展§≤

　　脂肪酸的(de)氣相(xiàng)色譜分(fēn)析由于它的(d§&e)極性和(hé)揮發性不(bù)好(hǎo)而帶來(láΩ"©i)麻煩，所以首先要(yào)把它的(de)φ↓$&極性羰基轉化(huà)成易于揮發的(de)非極性衍£♠×生(shēng)物(wù)。有(yǒu)多(duō)種烷基π'化(huà)試劑可(kě)以進行(xíng©¶↔±)羰基的(de)衍生(shēng)化(huà)≈δ✘，使用(yòng)最多(duō)的(de)是(>✘&shì)進行(xíng)甲基化(huà)，"♣↓特别是(shì)使用(yòng)氫火(huǒ)焰離∑¶"(lí)子(zǐ)化(huà)監測器(qì)(FID)氣相(xiàng)色®↕譜時(shí)，尤為(wèi)方便普及。但≠"☆γ(dàn)是(shì)使用(yòng)FID也(yě)有₩↔♠®(yǒu)一(yī)些(xiē)不(bù)足之處。絕±φ☆→對(duì)的(de)定量要(yào)依靠內(nèi)标物₩'<Ω(wù)的(de)信号強度，經常使用(yòng)的(de£≥♦←)內(nèi)标物(wù)是(shì)十七酸(而不(bù)是(≠σshì)使用(yòng)化(huà)學和(hé)物(wù)理(lǐ↕‌)性質與所測定脂肪酸相(xiàng)近(jì∑£n)的(de)同位素标記脂肪酸混合物(wù)作(zuò)內(nèi)标)。人(&≥♠rén)類體(tǐ)內(nèi)不(bù)能(néng)合€§成奇數(shù)碳鏈的(de)脂肪酸(包括碳17酸 ‍♥)，但(dàn)是(shì)人(rén)們可(kě)以通(tōng)過↓§₹食物(wù)攝取它們，它們存在于血液的(de)血漿中，增加內(nèi)标物(λ©★↑wù)十七酸的(de)量，從(cóng)而擾亂定量分(fēn€§)析。

　　進一(yī)步講，FID不(bù)能(néng)提£<®供分(fēn)子(zǐ)質量或其他(tā)結構特征信息，以便區(✔φ✘₽qū)分(fēn)不(bù)同的(de)脂肪酸，所以色譜和(hé)$£‌FID隻是(shì)解決把所有(yǒu)要(yào)研究的(¥"↓♥de)脂肪酸分(fēn)子(zǐ)完全分(fēn)離(lí)開(kāi↓ ‌)，用(yòng)質譜解決脂肪酸的(de)結₽‍π 構信息。大(dà)家(jiā)應該知(zhī)道(dào)使$φ✔用(yòng)電(diàn)子(zǐ)轟擊電ε‌≠≈(diàn)離(lí)脂肪酸分(fēn)子λ≥(zǐ)很(hěn)容易被打成碎片，通(tōng)過≠♥'♥這(zhè)些(xiē)碎片可(kě)以進行(xíng)脂肪α₹★酸的(de)結構分(fēn)析，但(dàn)是(sh♥₽→←ì)靈敏度受到(dào)限制(zhì)。弱電(diàn)離∞"×(lí)技(jì)術(shù)比如(rú)負化(huà)學電(diàn)‍✘離(lí)(NCI)可(kě)以改善檢測限。使用(yòng)鹵代衍¶←生(shēng)化(huà)試劑可(kě)以進一(yī)步提高(gāo)檢∑∑±測靈敏度，這(zhè)種試劑增加了(le)電(diàn)子(zǐ)親和®∞ δ(hé)力，可(kě)改善NCI-MS的(d♥π>πe)靈敏度。Kawahara 使用(yòng)五氟基苄(PFB) 作(zu✘∏£ ò)衍生(shēng)化(huà)試劑來(lái)衍生(sβ↑δλhēng)化(huà)有(yǒu)機(jī‌∞λ&)羧酸，這(zhè)樣的(de)含氟衍生(shēng)物(wù)電(di₩♦àn)子(zǐ)很(hěn)容易被俘獲。此後這(zhè)一(yī)方法擴£₩€‌展到(dào)脂肪酸的(de)衍生(shēng)化(✔₽ huà)為(wèi)脂肪酸酯，與脂肪酸甲酯₽&≤相(xiàng)比，它很(hěn)容易被NCI-M↕αS檢測。所以使用(yòng)五氟基苄進行(xí$÷ng)衍生(shēng)化(huà)有(yǒu)利于提∏®♣高(gāo)檢測靈敏度。許多(duō)研究者使用(yòng)PFB做(zuò)₩✘"®衍生(shēng)化(huà)試劑進行(xíng★•∑¥)脂質組學中的(de)脂肪酸分(fēn)析，例如(rú)Quehen∞♦>berger等就(jiù)是(shì)用(yòng)這(zhè)一(yī)ε≈方法分(fēn)析巨噬細胞中的(de)各種脂肪酸(Prostα‌aglandins, Leukotrienesand Essent>☆♣φial Fatty Acids，2008，79：123–☆₽129)。下(xià)圖4 是(shì)分(fēn)析★¥§ε巨噬細胞中的(de)各種脂肪酸的(de)色譜圖。

圖 4 巨噬細胞中的(de)各種脂肪酸的(de)色譜圖™¥₽β

圖中色譜峰的(de)脂肪酸如(rú)下(xià)：

(1)12:0; (2)14:0; (3)15:0; (4∏‌€)16:1; (5)16:0; (6)17:1; (7)1π↕←7:0;(8) a18:3; (9) 18:4; (10•>♣) g18:3; (11)18:2; (12)18:"σ♠•1; (13)18:0; (14)20:4;(15)≥§20:5; (16)11,14,17–20:3;(17•¶∏♠)bishomo-20:3; (18)20:2;‌×→ (19)5,8,11–20:3; (20)÷♥∑♦20:0; (21)22:6; (22)δ←≤₽22:4; (23)22:5; (24)22:2;(25)22‌←:3; (26)22:1; (27)22:0; (28) 23:0; ¶ >(29)24:1; (30)24:0;

3 國(guó)內(nèi)外(wài)進行(xín↓®g)氣相(xiàng)色譜分(fēn)析脂肪酸的(de)一(yī)₩✘些(xiē)例證

　　為(wèi)了(le)進一(yī)步了(₩®le)解進行(xíng)氣相(xiàng)色譜分(fē→$π∏n)析脂肪酸的(de)具體(tǐ)情況，下(xià)面₽ε∏表1列出近(jìn)50例分(fēn)析各種樣品中↑ β脂肪酸的(de)色譜柱和(hé)分(fēn)離(l ‍→í)對(duì)象。表2列出國(guó)外(wài)文(wén)獻中分(fē★✘↔λn)析人(rén)體(tǐ)組織中脂肪酸的(de)例證☆"≈★。

表 1 國(guó)內(nèi♣φ₩÷)氣相(xiàng)色譜分(fēn)析脂肪酸的(de)色譜柱和(hé)©≠"π分(fēn)析對(duì)象

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表 2 國(guó)外(wài)文(wé‌♠n)獻中有(yǒu)關分(fēn)析人(rén)體(tǐ)組織中脂肪酸的(≠₩de)衍生(shēng)化(huà)方法和(hé±§λ>)所用(yòng)色譜柱

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4 脂肪酸氣相(xiàng)色譜分(fēn)析所用(yòn'₩÷₹g)色譜柱

　　從(cóng)已發表的(de)文(wén)獻看(kàn)分(&δ≈fēn)析整體(tǐ)脂肪酸需用(yòng)非極性的(de)聚矽氧 Ω'↓烷毛細管色譜柱，如(rú)聚二甲基矽氧烷，分(f∞→ēn)離(lí)多(duō)不(bù)飽和(λαφhé)脂肪酸需用(yòng)極性強的(de)色譜柱，如(rú)₽ OV-275，OV-275(這(zhè)是(shì)聚矽氧烷固定相←ε♥(xiàng)中極性最強的(de)色譜柱)和(hé)CP§ε₩-Sil 88(HP-88)。據安捷倫公司一(yī)份研究報(bào)告®→π∞(5989-3760 EN)，他(tā)¥≠∞Ω們對(duì)最重要(yào)的(de)一(∑₽→δyī)些(xiē)脂肪酸(甲酯)(見(jiàn)表3)進行(x≥<ε'íng)研究，研究總結認為(wèi)：聚乙二醇柱對(duì)不(bù) ÷✔太複雜(zá)的(de)樣品可(kě)以得(de)到(dào)很(©₩hěn)好(hǎo)的(de)分(fēn)離 ∞•✘(lí);而中等極性的(de)氰丙基聚矽氧烷柱(D₹"δB 23)對(duì)複雜(zá)的(de)™γ ∞ FAMEs 樣品可(kě)以得(de)到(dào)很(hěn)好(h←♣✔φǎo)的(de)分(fēn)離(lí)，對(Ω₹duì)一(yī)些(xiē)順反異構體(tǐ)也(♦↕₹yě)可(kě)以得(de)到(dào)分(fēn)離(l♦®£í); 要(yào)使順反異構體(tǐ)分(fēn)離(lí)的(de)更✔ 好(hǎo)，就(jiù)要(yào)使用(y&♠✘‌òng)更高(gāo)極性的(de) HP-88 氰丙基色譜$✔柱。

表3 重要(yào)的(de)一(yī)些(xiē)‍★'脂肪酸

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