高(gāo)效液相(xiàng)色譜技(j¶±δ ì)術(shù)最早應用(yòng)于藥物(wù)領域，包括效能("♥↕néng)/純度/性能(néng)分(fēn)析、✔δ藥物(wù)(代謝(xiè))動力學/生(shēng)物(wù≥≈≥)分(fēn)析測試、純化(huà)、高(gāo)通(tōng)量篩選(  ×™HTS)、過程控制(zhì)(IPC)監測和(hé)質量控制(zhì)(QCφ ")測試。制(zhì)藥行(xíng)業(yè)是(‍☆ ≈shì)HPLC的(de)主要(yào)應®$✘±用(yòng)市(shì)場(chǎng¥ε≈)，同時(shí)也(yě)是(shì)HPLC向更高(gāo)通(tōδ ng)量和(hé)更優性能(néng)發展的(de)主要(₹ ↔♥yào)驅動力。本文(wén)簡要(yào)回顧了(le)過去(qù)十年(n$♦↕ián)影(yǐng)響藥物(wù)分(fēn)析發展的(de)HPLC₽≠γ♠的(de)重大(dà)進展。討(tǎo)論的(de)主題如(r€↕ú)下(xià)，部分(fēn)項目體(tǐ)現(xi♠∞àn)在一(yī)個(gè)典型的(de)時(s®¥₽hí)間(jiān)軸上(shàng)，如(rú)圖1所示。

• 　　儀器(qì):超高(gāo)壓液相(xiàng)色譜(UHPLCφλ©)走向主流。
• 　　色譜柱:Sub-2μm,sub-3μm核殼和(hé≤' )混合粒子(zǐ)；新穎的(de)鍵合化(huà)學反應；親水(shuǐ ∏)作(zuò)用(yòng)色譜法(HIL✔>IC)；多(duō)糖類手性固定相(xiàng)；生(shē<₽ng)物(wù)分(fēn)子(zǐ)和(hé)生(shēn≈×g)物(wù)制(zhì)藥柱子(zǐ)。
• 　　其它:液相(xiàng)色譜-質譜(LC/MS)&m✔​✘dash;特别是(shì)高(gāo)分(f₹"↑₩ēn)辨質譜(HRMS)或混合質譜；電(diàn)霧式檢測器(qì)(C&∞AD)；自(zì)動方法開(kāi)發系統(AMD∏★βS)。

圖1 過去(qù)十年(nián)中影(yǐ$✔ng)響藥物(wù)分(fēn)析發展的(de)HPLC技(jì>$β∏)術(shù)進展(部分(fēn)項目)

　　本文(wén)的(de)目的(de)是(shì)為(wèi)繁忙的(de' )制(zhì)藥科(kē)學家(jiā)提供一(yī)個(gè)簡潔又(yòu•  <)全面的(de)HPLC的(de)重要(yào)的(de)技(j ​​ì)術(shù)進展,每個(gè)主題都(dōu)有(yǒ©≠u)實際使用(yòng)過程中的(de)便利和(hé)應用(yòγ$¶↑ng)的(de)簡短(duǎn)描述，從(cóng)用(yòng)戶的(de≥‍)角度的(de)評論，以及主要(yào)參考文(wé★π₩$n)獻(略)的(de)支撐。

　　超高(gāo)壓液相(xiàng)色譜(UHPLC)

　　UHPLC的(de)革命性創新始于1↕β÷997年(nián)James Jorgenson教授在概念驗證方面的↔δ(de)研究，緊接著(zhe)第一(yī)個¥ ✘(gè)商業(yè)化(huà)系統于2004年♥β(nián)推出。今天，從(cóng)HPLC到☆∞<✘(dào)UHPLC的(de)轉化(huà)大(dà)部分(fē✔‍α↔n)都(dōu)是(shì)由主要(yào)制(zhì)造商完成，這(£&©↑zhè)些(xiē)制(zhì)造商目前都(dōu)可(kě)以供應某種​♥ ≠類型的(de)UHPLC産品。UHPLC系統、柱子(zǐ)以及應用(yòn₽ "×g)的(de)詳細綜述在其他(tā)地(dì)方都(dōu)φ↕"'可(kě)以看(kàn)到(dào)。UHPLC在藥物(wù±λ')分(fēn)析領域的(de)基本原理(lǐ)、優勢、潛在σ♥©€的(de)問(wèn)題和(hé)最佳應用(yòng)都(dōu λ∑₽)有(yǒu)充分(fēn)的(de)文(​←×wén)件(jiàn)記錄。

　　表1概述了(le)UHPLC的(de)突出÷☆₽特點和(hé)優勢。注意，較高(gāo)的(de)系統壓力允許使用(φ®yòng)更小(xiǎo)的(de)微(wēi)粒填充的(de)柱子(zǐ÷←)(如(rú)亞2μm)得(de)到(dàσλo)更快(kuài)的(de)分(fēn)析≤π≠速度(圖2)或複雜(zá)樣品更出色的(de)分(fēn)離(lí)(Ω↔圖3)。由于使用(yòng)改良的(de)進樣器(qì)，內(nèi)徑較小(δ xiǎo)的(de)管路(lù)系統(< 0.005英寸)，更小®φ (xiǎo)的(de)紫外(wài)檢測器(qì)流∑×®動池(0.5 - 2μL)，所有(yǒu)的(de)UHPLC都(dōu γ)有(yǒu)比較低(dī)的(de)系統擴散(4σ時 £₹​(shí)，~10-20μL)。比較典型的(de)應用(yò ♠ng)是(shì)內(nèi)徑為(wèi)2.1–3.0mmα "δ的(de)柱子(zǐ)，填充物(wù)為(wèi)亞2μm或亞©✔©π3μm顆粒。其他(tā)重要(yào)的(de)♦α  系統特征包括更小(xiǎo)的(de)系統死體(tǐ)積(0.1≥∞-0.3 mL)和(hé)更快(kuài)的(d≤®e)檢測器(qì)響應/數(shù)據采集速率(>4✘≠∑0 pt/s)，以實現(xiàn)高(gāo)通(tōng)量的•♥(de)應用(yòng)。

表1 UHPLC的(de)突出特點和(hé)優勢

UHPLC的(de)系統特點	範圍和(hé)評論
最高(gāo)壓力限制(zhì)	15000到(dào)19000ps↑✘₩i(1000到(dào)1250bar),流速2-5mL↕"×/min.兼容傳統的(de)和(hé)亞-2微(wēi)米顆₩$≠↔粒的(de)色譜柱。
低(dī)系統色散	根據儀器(qì)配置，儀器(qì)帶寬5σ→-20μL（4σ），使用(yòn≥•λg)較小(xiǎo)的(de)連接管（<0.005&Ωβquot;I.D）和(hé)小(xiǎo)UV流通(tōng)池（0.5-2‌₩✔₹μL）,減小(xiǎo)系統頻(pín)帶展寬。兼容ID低"  ₽(dī)至2-3mm的(de)色譜柱。
低(dī)的(de)梯度保留體(tε↓ǐ)積	100-400μL（對(duì)于四元液相(xiàng)泵會(∞± huì)更高(gāo)），兼容高(gāo)通(tōng)'•¥量篩選（HTS）。小(xiǎo)的(de)保留（✘← 混合）體(tǐ)積可(kě)能(néng)影(yǐng)響UV檢測器&®☆(qì)噪聲。
其他(tā)	HTS快(kuài)速的(de)注 ☆射周期（-20s）和(hé)檢測響應，以及高(gāo)的(de)¶€采集率（>40pt/t），兼容目前的(de§≠™)HPLC方法需求（如(rú)流量範圍、柱溫箱尺≤β寸、進樣環路(lù)）
UHPLC的(de)優勢	評論
高(gāo)通(tōng)量	在保持相(xiàng)似分(fēn)辨率的(de)€← 情況下(xià)，與傳統的(de)HPLC方法相(xià€↔γng)比通(tōng)量提高(gāo)3-10倍。如(≤€ ‌rú)純度分(fēn)析5min（UHPLC）/20min（HPLC）。★φ§
快(kuài)速方法開(kāi)發	短(duǎn)色譜柱，快(kuài)速分(fēn≠♥∞)析是(shì)色譜柱和(hé)流動相( 'xiàng)快(kuài)速篩選及方法優化(huà)的(de)理(lǐ)σβ想選擇。
高(gāo)分(fēn)辨	相(xiàng)對(duì)于δε✔βHPLC，分(fēn)辨率提高(gāo)3倍，比如(rú±β)峰容量（Pc）400-600(HPLC為(wèi)200)
溶劑節省	分(fēn)析時(shí)間(jiān)短(d≠✘uǎn)，使用(yòng)較小(xiǎo)ID的(deα☆)色譜柱，相(xiàng)比HPLC溶劑節省5-15倍。
高(gāo)靈敏度	質量靈敏度增加3-10倍（樣品注入量減≤<±↓少(shǎo)）。長(cháng)路(lù)徑UV流通(tōn↕→₽g)池（50-60min）可(kě)以将濃度靈敏度提高(gāo)6倍£¶'​。
高(gāo)精度	保留時(shí)間(jiān)（2-3倍​β）和(hé)峰面積精密度（<1%RSD，進樣體(tǐ)積>•∏♠α;1μL ）顯著增加
可(kě)以與其他(tā)的(↓✘γ✘de)方法聯用(yòng)	UHPLC兼容高(gāo)溫LC，2D-LC或者核殼色譜柱（單一δ≥(yī)或者組合聯用(yòng)）。這(zhè)些(xiē)都(dōu) ★是(shì)可(kě)選項，而不(bù)是(shì)“有®β(yǒu)它就(jiù)不(bù)能(néng)有→σ↑"(yǒu)它”。

 

　　與傳統的(de)HPLC相(xiàng)比，UHPLC具有(yǒ​"u)分(fēn)析速度快(kuài)的(de)優勢，圖2闡述了(♦←≤>le)一(yī)種藥物(wù)分(fēn)析由HPLC方法轉移為(wèi)​π₽UHPLC方法的(de)譜圖對(duì)比。從(cóng)HPLC到(ε  dào)UHPLC，根據幾何尺寸按比例縮放(fàng)色譜§★÷ 柱及操作(zuò)參數(shù),可(kě)以在相(xi₹"<σàng)同分(fēn)辨率的(de)情況下(xià)将分(fēn)析時≠↕<↕(shí)間(jiān)減少(shǎo)10倍，這(zhè)并不(bù)罕<←₹↔見(jiàn)。“保證好(hǎo)的(de÷≠×)分(fēn)辨率的(de)情況下(xià)進行(xíng)更快(kuàΩσδi)的(de)分(fēn)析”這(zhè)是(shì&£∏±)大(dà)多(duō)數(shù)用(yòng)戶考慮購( ÷gòu)買更昂貴的(de)UHPLC設備✔≤的(de)主要(yào)誘因。

　　UHPLC的(de)另一(yī)個(gè)重要(yào)的(d↓✘£ e)好(hǎo)處是(shì)其對(duì)複雜(zá)樣品優秀的(de)≠≥♦分(fēn)離(lí)能(néng)力。這(zhè)方面常常被忽視(₩∞∏¶shì),在文(wén)獻中也(yě)很®≤(hěn)少(shǎo)報(bào)道(dào)。在合理(lǐ)的©×₹✘(de)時(shí)間(jiān)跨度(~1 h)內(↓‌←♣nèi)，400至1000範圍內(nèi)的('σ♥÷de)峰容量(PC)已經通(tōng)過使用(yòng)UH≤≥σ←PLC來(lái)證實。峰容量是(shì)分(fēn)辨率為(wèδ↔✔i)1.0時(shí)，色譜圖上(shàng)可(kě)以分(fēn)辨的✔₩(de)色譜峰個(gè)數(shù)；通(tōng)常傳統的(de)HP©∑LC為(wèi)200左右。有(yǒu)史以來(lái)$≈≥φ第一(yī)次,UHPLC可(kě)以在單一(yπε↔ī)維度,對(duì)複雜(zá)的(de)藥品、天然材料•≥÷¥、和(hé)其他(tā)困難樣品基質提供Ω≠更有(yǒu)效的(de)分(fēn)析。圖3a和(hé)3b通(tō™γ>λng)過兩個(gè)應用(yòng) (植物(w∞¥↔♦ù)提取物(wù)和(hé)胰蛋白(bái)酶的≠ ​(de)消化(huà)蛋白(bái)質)來(lái)說(shuō)明(míng∏ ✘σ)Pc>300時(shí)，當前UH®↕PLC的(de)高(gāo)分(fēn)辨分(fēn)離(l>π✘í)能(néng)力。

　　UHPLC的(de)其他(tā)優勢  ε≠包括溶劑節省(5-15倍),增強的(de)↑ 質量靈敏度(3-10倍)，以及在保留時(shí)間(ji≈≤↓"ān)(2–3倍)和(hé)峰面積(<÷<0.1%RSD)方面的(de)卓越性能(n✔♣éng)。注意，有(yǒu)關UHPLC♠®α中UV檢測靈敏度增加的(de)報(bào)告往往會(∞λδhuì)産生(shēng)誤導,因為(wèi)‍<≈≈質量敏感度(分(fēn)析物(wù)注入量)主要(yào)與柱的∏↑₽(de)空(kōng)隙體(tǐ)積有(y∏<÷•ǒu)關。通(tōng)常，UHPLC不(bù)會(huì)增加濃度靈敏度(最₽♣πλ理(lǐ)想的(de)一(yī)種靈敏度),因為 ∞(wèi)我們不(bù)能(néng)希望使用(yòng)小(xiǎo)的(d$γe)流通(tōng)池來(lái)增加信噪比，除非延長(cháng)流通(δ¥tōng)池的(de)路(lù)徑長(cháng)度 (如(rú)60 ←≥φ毫米)。泵混合而導緻的(de)粘性發熱(rè)、基線擾動以及方法轉 ≥♠✔移等潛在問(wèn)題已經有(yǒu)文(wén)獻描 ¶述，而且這(zhè)些(xiē)問(wèn)題分(fēn)别也₹룩(yě)是(shì)與特定的(de)儀器‍♠↕​(qì)相(xiàng)關聯的(de)。一(yī)≥✘☆ 般來(lái)說(shuō),這(zhè)些(xi♥¥ ∏ē)技(jì)術(shù)問(wèn)題已經研究得∞α(de)比較清楚了(le)，而且通(tōng)過 ✘©選擇合适的(de)系統配置(如(rú)混合器(©σqì)體(tǐ)積)能(néng)夠很(hěn)容易地(dì)減輕。但(dàn↕γ¥$)是(shì), 由于培訓、與驗證數(shù)據系統的(de)×₹兼容性和(hé)其他(tā)方法轉移的(de)問(w>♠™πèn)題，UHPLC在QC實驗室的(de)應用(yòng)仍 ∞然比較浪費(fèi)時(shí)間(jiān)。

　　圖2 以商業(yè)制(zhì)藥配方(R€↑♠apidocain) 質量控制(zhì)分(fēn)析為(wèi)例：•™β×從(cóng)傳統的(de)HPLC到(d ∑♣↑ào)UHPLC使用(yòng)幾何比例±σδ縮放(fàng)。峰識别:1:對(duì)羟基苯•₩"'甲酸甲酯,2:2、6-二甲基苯胺,3:尼泊金(jīn)丙酯,4♥∞<×:利多(duō)卡因。HPLC條件(jiàn):色譜柱RP18 150₽α x4.6毫米,5μm, F=1ml/min, £‍ →Vinj=20μL。UHPLC條件(jiàn): 色譜♥✘ ∑柱RP18 x2.1 50毫米,1.7μm,F = 6☆£00μL /min,Vinj = 1.4μL。超快(k€→×uài)UHPLC條件(jiàn):色譜柱RP18 x2.1 β→¶γ50毫米,1.7μm,F = 1000μL /min,Vinj ≥÷=1.4μL[16]。

　　我們經常聽(tīng)到(dào)一(yī)些(xiē↔λ'∞)争論，UHPLC也(yě)許并不(bù)需要(yào),因¶ ₽為(wèi)其他(tā)方法(高(gāo)溫L♥±σ→C、核殼柱子(zǐ)或二維LC)可(kě)以更合算(suàn)的(‌σπ​de)提高(gāo)速度或分(fēn)辨率。這(zhè)種推理(lǐ)并↑↓不(bù)是(shì)真實有(yǒu)根據↑♠×₽的(de)，因為(wèi)與傳統的(de)HPLC相(xiàng)比，U→≈HPLC在使用(yòng)過程會(huì)中§♥可(kě)以與一(yī)個(gè)或多(duō)個(gè)以上(sh §≥àng)的(de)這(zhè)些(xiē)方法聯用(yòng)獲得(de)γ☆‍更出色的(de)結果。這(zhè)些(xiē)方法都(•→γ↔dōu)是(shì)可(kě)選項,而不(bù)是(shì)&ldquo±✘₽;有(yǒu)它就(jiù)不(bù)能(néng)有(yǒu)它&‍♣γrdquo;。此外(wài),&ldquπ$≈£o;UHPLC”這(zhè)個(gè)詞語可(kě)©¥能(néng)在幾年(nián)內(nè→γ<¥i)最終消失，因為(wèi)所有(yǒu)新的(de)HPLC都(dōu)是∞↔ (shì)UHPLC了(le)。

　　HPLC色譜柱和(hé)固定相(xiàng)的(↓≈Ω de)發展

　　HPLC色譜柱是(shì)色譜系統♣ λ✔的(de)核心。在堿性分(fēn)析物(wù)分(fēn)析方面，←λ&•制(zhì)藥業(yè)一(yī)直是(shì)HPLC色譜柱向高(gāo₹↓•)速、高(gāo)分(fēn)辨率、更好Ω"ε¶(hǎo)的(de)峰形發展的(de)主要(yào)驅動力。此外(w≈σài),QC實驗室已經被要(yào)求改進色譜柱的(de)批次重↔&≈¥現(xiàn)性。從(cóng)70年(nián)代到(dào)90年₽"(nián)代,在填充材料的(de)标準顆粒尺度(10-3✔¥₽¥μm)的(de)逐級縮小(xiǎo)方面已經有(yǒu)≈₩↔穩定的(de)改進。80年(nián)代後期，高(gāo)純度B型矽材料(低≠≠(dī)金(jīn)屬含量)的(de)引入是(≈ εshì)一(yī)個(gè)巨大(dà)進步,減‌>""少(shǎo)了(le)矽醇的(de)活性，并在批次間(jiān)的(de)≤σ'±一(yī)緻性方面有(yǒu)重大(dà)改進。現(xiàn)在高(gāo)純↕•σ矽的(de)使用(yòng)是(shì)所有(yǒu)現(x±∏ iàn)代矽膠基質色譜柱的(de)标準。

　　圖3 UHPLC 高(gāo)分(fē∏•≤€n)辨率分(fēn)離(lí)(C18色譜柱，填充亞2μm顆粒)。(A)✔↓銀(yín)杏标準化(huà)提取物(wù)的(de)色譜圖。梯度：5%≥σ‌到(dào)40%的(de)乙腈，120分(fēn)鐘λ<↕(zhōng)，T=30°C, Lcol =♣α 300mm，F = 0.2 mL/min,ΔPmax =¥✔ 860 bar,峰容量可(kě)以達到(dào)360；(B)三種蛋白•>™•(bái)質的(de)結合胰蛋白(bái)酶消化(huà)酶的(de)色譜≠ε​圖。梯度：5%到(dào)60%的(de)乙腈π∑€δ，120min ，T=30°C，Lc♦ ‍ol = 40cm,F = 0.16 m¶©λ★L/min,ΔPmax = 940bar,峰容量可(kě)₹ ♥©以達到(dào)410。

　　HPLC色譜柱技(jì)術(shù)λ÷¥的(de)近(jìn)期進展已經被廣泛地(dì)綜述(已經有(yǒu)很(h✔↑≤φěn)多(duō)文(wén)獻綜述并討(tǎo)論了(le)HPLC的↔↑♠(de)色譜柱技(jì)術(shù)的(de)近(jìn)期進展)£↑∑。表2總結了(le)重大(dà)行(xíng)業(yè)使用(yòn✔<₹g)率較高(gāo)的(de)，用(yòng)于提高(gāo)生(shēng)←₹>産力、穩定性、選擇性或保留時(shí)間(jiā£≠Ω♥n)(亞2μm,核殼粒子(zǐ),混合物(wù),新奇的("‍de)鍵合反應,HILIC)或專業(yè)應用(yòng‍€​) (手性化(huà)合物(wù)或生(shēng™♣)物(wù)分(fēn)子(zǐ))的(de)色譜柱。

表2 影(yǐng)響藥物(wù)分(fēn)析的(de)Ω¥©重要(yào)的(de)HPLC色譜柱的(de)研究進展

HPLC色譜柱重要(yào)研究進展	評論
亞2μm顆粒	全孔亞2μm顆粒産生(shēng)≠→較低(dī)的(de)塔闆高(gāo)度和•ε(hé)高(gāo)的(de)塔闆效率。10多(duō)家(jiā)供應商提供£$超過80種可(kě)用(yòng)的(de)化(huà€©)學反應，包括離(lí)子(zǐ)交換、尺寸排阻等。
亞3μm核殼顆粒	表面多(duō)孔型亞-3μ×↓↕≠m顆粒在低(dī)柱壓條件(jiàn)下(xià)提供改善的(≈§de)質量傳遞和(hé)較低(dī)的(de)塔闆高(gāo)度。增加 €了(le)在藥物(wù)分(fēn)析中的™¶πβ(de)使用(yòng)案例。
混合矽顆粒	創新的(de)顆粒提高(gāo)♦↑ 色譜柱的(de)化(huà)學穩定性（擴大(dà)pα<H範圍、溫度和(hé)壓力性能(néng)，親矽醇基活性）
新奇的(de)鍵合化(huà)學反應	多(duō)官能(néng)團的(de)矽烷化(huà) ☆↑∞學、極性嵌入式鍵合相(xiàng)、五氟λ↑苯酚（PFP）、 苯基-己基、表面帶電(★φ> diàn)雜(zá)化(huà)（CSH）相(xiàng)¶‌，提供“正交”分(fēn)離(lí)和(hé)增♥↔'強的(de)選擇性（與傳統的(de)C18鍵合相(xiàng)相(​‌xiàng)比）
親水(shuǐ)作(zuò)用(yòng)色譜（HILIC）	反相(xiàng)色譜的(de)&↔≤÷✔ldquo;正交”分(fēn)離(lí)對(duì)強極性化(hu→π↕à)合物(wù)和(hé)次生(shēng)代謝(xiè<£')物(wù)有(yǒu)用(yòng)
用(yòng)于手性分(fēn)離(↑↓lí)的(de)多(duō)糖固定相(xiàng)	多(duō)糖手性固定相(xiàng)使得(de)通(t™✘≥ōng)常的(de)色譜柱具有(yǒu)多(duō)用(yòng)性和(≈γγ∏hé)抗造性
生(shēng)物(wù)分(fēn)子(zǐ)色譜柱	創新的(de)核殼結構和(hé)UHP$∑LC大(dà)孔徑固定相(xiàng)可(kě)以有∑∞≈(yǒu)效改善蛋白(bái)質和(hé)治÷↓療性生(shēng)物(wù)分(fēn)子(zǐ)（如(rú)mA ® bs）的(de)分(fēn)析。

 

　　亞2 μm顆粒

　　1956年(nián)，Van Dee₩∏mter就(jiù)給出了(le)使用(yòng)非≈®常小(xiǎo)的(de)顆粒進行(xínπ↕®•g)快(kuài)速、高(gāo)效分(fēn)離(lí)的(de)預測∏ε§。在過去(qù)五年(nián)中，典型填•±料的(de)粒徑在不(bù)斷的(de)減小(xiǎo)，二十一(yī)世紀初✘™₹，集中在亞2μm的(de)矽微(wēi)顆粒≥<↓。正如(rú)預測的(de)那(nà)樣,這(zhè)些(xiē)™★粒子(zǐ)(例如(rú),1.7μm)産生(shēng)卓越的(de)£"×±性能(néng)(~ 280000 plateλ≥≥s/m或~ 4μm/plate)。然而,填充亞2μm粒子≤±±'(zǐ)的(de)色譜柱産生(shēng)高(gāo)的(de)背壓，通(tō↕±§×ng)常填充內(nèi)徑為(wèi)2.1毫米，通(tōng)過粘性發熱(rφ×è)減少(shǎo)效率損失。對(duì)高(gāo)壓<÷'β力和(hé)低(dī)分(fēn)散(減少(shǎo)附加柱的ελ<(de)譜帶展寬)系統的(de)要(yào)求導緻了(le)現(xiàn)​→↓¥代UHPLC系統的(de)當前特點。進一(yī)步降低(dī)≈®®粒徑至小(xiǎo)于1.5μm可(kě)能(néng)ᶱ會(huì)産生(shēng)更高(gāo)的(de)速度∞£♠←和(hé)性能(néng)。然而,它也(yě)必須伴随著(zhe)系統壓力的(∑δ'÷de)大(dà)幅增加和(hé)毛細管色☆↔譜柱內(nèi)徑的(de)減小(xiǎo)。

　　核殼結構顆粒

　　Kirkland第一(yī)次描述了₽σ(le)熔融的(de)核或者核殼粒子(zǐ)的(de)概念，₩≠減少(shǎo)質量轉移過程中的(de)阻力。第一($ yī)個(gè)核殼粒子(zǐ)具有(yǒu)如(rú)☆‍®δ下(xià)特點:2.7μm表面多(duō©‍δ)孔矽材料，無孔的(de)核心(1.7μm)，多(du✘‍ō)孔的(de)殼層(厚0.5μm)。€ ×這(zhè)些(xiē)亞3 μm的(de)顆粒與亞2μm的(de→♥<)完全多(duō)孔材料相(xiàng)比似乎具有(yǒu)相(x×♣×iàng)似的(de)效率，但(dàn)是(shì±£$)可(kě)以産生(shēng)更低(dī)的(deδ'•)壓降。這(zhè)種特殊的(de)性能(néng)可(♠πkě)能(néng)是(shì)由于殼體(tǐ)較短(dε→σ​uǎn)的(de)擴散路(lù)徑，或者比較狹窄的(de)填料分(fēn)§Ω布。由于快(kuài)速分(fēn)離(lí)(§♠​×HIS、IPC和(hé)清潔驗證)和(hé)在生(shē÷↓&'ng)物(wù)分(fēn)子(zǐ)方面∑♣←Ω的(de)應用(yòng)，核殼色譜柱迅速獲得(d&γe)廣泛的(de)接受。越來(lái)越多(duō)的(de)≥™✘β制(zhì)造商可(kě)以提供各種鍵合相(xiàng)和(hé∑​≥∑)不(bù)同尺寸的(de)粒子(zǐ)(1•←≠.3,1.7,2.6,1.3和(hé)5μm)。我們完全相↔δ‌λ(xiàng)信，與多(duō)孔微(wēi)細顆粒的'>✔↔(de)色譜柱相(xiàng)比，這(z®Ω≈$hè)些(xiē)色譜柱在所有(yǒu)應用(yòn™∞↕g)中具有(yǒu)很(hěn)大(dà)的'δ∞≤(de)競争力。

　　圖4 10種具有(yǒu)酸性、堿性和(hé)中性官能(néng₹↑​€)團的(de)商品化(huà)藥物(wù)在BEH和(hé)CSH分(fēn)<•析柱的(de)分(fēn)析比較，梯度洗脫，流動相(↔δ>∑xiàng)含乙腈和(hé)0.1%的(de)甲酸。峰1、4β↑©、6和(hé)8是(shì)基本藥物(wù)。從(cóng)文(wén)獻£'中複印,已取得(de)許可(kě)。

　　雜(zá)化(huà)

　　将有(yǒu)機(jī)基團引入到(dào)無機(jī)矽基體(tǐ)中>π形成雜(zá)交顆粒的(de)理(lǐ)念在上(s✘®↔hàng)世紀70年(nián)代首次由Unger提出，雖然第一Ω≤(yī)根具有(yǒu)甲基基團的(de)商業(yè)化(h‌ uà)的(de)色譜柱在1999年(nián)才正式推出。這(zhè)&₹β≤些(xiē)混合物(wù)中的(de)鍵合相(xπ☆iàng)被證明(míng)具有(yǒu)π&∞•很(hěn)好(hǎo)的(de)pH穩定性(具有(yǒu)新奇的(d"♥₹"e)鍵合化(huà)學反應的(de)pH範圍為(w↓₹☆₩èi)1到(dào)12,而傳統的(de)具有(yǒu)常規單©'功能(néng)鍵合矽顆粒的(de)pH範圍為(wèi)2-8∑¥"¶),低(dī)的(de)親矽羟基活性。2005年(π↓≠←nián)，引入第二代橋聯乙烯雜(zá)化(huà) (BEH)，并立即Ω→獲得(de)了(le)“主流”成功,特β∞♣$别是(shì)高(gāo)pH值流動相(xiàng)以及UHPLC的(d× β¥e)應用(yòng)方面。

　　新奇的(de)鍵合反應

　　或許是(shì)因為(wèi)批次之間(jiān)重現(σ♦¥xiàn)性最好(hǎo),傳統的(de)單官能(néng)團的(de) ®↑C18矽膠基質鍵合相(xiàng)仍是(shì)主要(yào)的(d•β∑e)産品,但(dàn)是(shì)新的(de)鍵合化(huà)學反×≤‌φ應給困難的(de)分(fēn)離(lí)(極性嵌入式、苯基、己基苯基、含氰≥® 基的(de)、戊烷氟苯基鍵合)帶來(lái)✘φ±☆了(le)更寬的(de)pH值穩定範圍(多('✔λΩduō)官能(néng)的(de)矽烷化(huà)學鍵或異丙基保護的(d•¥e)矽烷)和(hé)增強的(de)選擇性。最近(jìn)的(dΩ→e)一(yī)個(gè)創新方法稱為(wèi¶ε)表面帶電(diàn)雜(zá)化(huà)(CSφ‌H)技(jì)術(shù)，該項技(jì)術(shù)于2010年(nián)§‌✔™引入,由于在酸性,低(dī)離(lí)子(zǐ)強度流動相(xiàn$‍ g)條件(jiàn)下(xià)，對(duì)高(gāo)堿性分(fē ↓n)析物(wù)的(de)峰形的(de)改善，該項技(jì)術(sh©←≈™ù)立即在藥物(wù)分(fēn)析領域獲得(de)了(l₹↕≠e)很(hěn)好(hǎo)的(de)接受↓™度(如(rú)0.1%甲酸)。這(zhè)項專有(yǒu)技('σjì)術(shù)包括在固定相(xiàng)表面引入低(dī)水(shuǐ)平β≠♥的(de)正電(diàn)荷。這(zhè)類似于早期在流動相(xià∞>ng)中添加有(yǒu)機(jī)胺，如(rú)三"₩☆×乙胺，但(dàn)由于離(lí)子(zǐ)抑制(zhì)，•↓€•已經不(bù)被LC/MS接受。圖4說(shuō)明(mínε←₹g)了(le)與現(xiàn)在的(de♥•β<)鍵合相(xiàng)相(xiàng)比，CSH顆粒在峰形方面表現(​‍♦xiàn)的(de)優勢。注意,酸性化(huà)合物(w✘•ù)在CSH柱子(zǐ)上(shàng)會(huì)有(yǒu"≠↑)相(xiàng)對(duì)較高(gāo∑ )的(de)保留，峰拖尾現(xiàn)象也(yě)≤δ↓會(huì)有(yǒu)所增加。

　　親水(shuǐ)作(zuò)用(yò✘←α↑ng)色譜(HILIC)

　　在反相(xiàng)LC(RPLC)條件(jiàn)下(xià)，若✔¥<流動相(xiàng)中有(yǒu)機(jī)物(wù)含量比較低(÷÷dī)，就(jiù)會(huì)導緻相(x¶←>‌iàng)坍塌現(xiàn)象(鍵合相(xiàng‌Ω™ε)脫水(shuǐ))，許多(duō)強極性化(huà)合物(wù)就(jiù≤♣γ)無法獲得(de)足夠的(de)保留時(shí)間(jiān)或者會(<≤huì)存在問(wèn)題。HILIC模式, 90年(niá∞♦n)代由Alpert首次開(kāi)發,使用(yòng)親水(s←‍"huǐ)固定相(xiàng)(矽、二醇、氰基、氨基、兩性離(γλ€lí)子(zǐ)的(de))，類似RPLC使用(yòng)的(de)"₽α水(shuǐ)緩沖和(hé)乙腈流動相(xiàng),在極性藥物(‌Ω≈πwù)分(fēn)析、輔助藥物(wù)代謝(xiè)、氨基酸、多(duō)肽£₩、神經遞質、低(dī)聚糖、碳水(shuǐ)化(h✘±♠≤uà)合物(wù)、核苷酸或核苷方面的(de)分(fēn)析中←×λ越來(lái)越受歡迎。HILIC實際的(de)保留機(jī)制( €β>zhì)可(kě)以認為(wèi)是(shìε£)分(fēn)析物(wù)分(fēn)子(zǐ)“分(∑₹←fēn)區(qū)”到(dào)附著> ↕(zhe)在親水(shuǐ)結合基團的(de)水(s✔εhuǐ)層。與RPLC相(xiàng)比，HILIC其他(tā)突‌Ωπ出的(de)優勢包括“正交&rdq×♥☆♣uo;選擇性(樣品制(zhì)備兼容兩種模式),≤ε對(duì)質譜具有(yǒu)更高(gāo)的(de)電(diàn)噴¶∏<←霧離(lí)子(zǐ)化(huà)靈敏度(5-15倍),較"€‍低(dī)的(de)操作(zuò)壓力。

　　固定化(huà)多(duō)糖手性固定相(xiàng)

　　成功包覆的(de)多(duō)糖手性固定相(xià××σ×ng)(CSPs)的(de)改進版本在2000年(nián)代末實δ‍現(xiàn)。與早期的(de)CSPs具有(y₹ ₩ǒu)相(xiàng)似的(de)多(duō)功能(néng)，₩•π但(dàn)是(shì)對(duì)于腐蝕性的(d✘¶↓e)溶劑具有(yǒu)更好(hǎo)的(de)穩定性劑,可(kě)用(y¶¶òng)于正相(xiàng),極性有(yǒu)機≤★±(jī)和(hé)反相(xiàng)模式≠≤。

　　用(yòng)于生(shēng)物(wù)分(fēn)子(∞<≤♠zǐ)的(de)色譜柱

　　80年(nián)代發展起來(lái)的(de)大(dà)孔'α↓徑矽和(hé)聚合物(wù)填料可(kě)有(yǒu)效解決大(dà)型生(±‍shēng)物(wù)分(fēn)子(zǐ)的(de)分(fēn)離(lí)。‍λ♦‍随著(zhe)重組蛋白(bái)，如(rú)單克隆抗體(tǐ≤δ)(mAb)等生(shēng)物(wù)制(zhì)藥的(de)出現♠  ¶(xiàn)，質量控制(zhì)中利用(yòng)HPLC和(hé)毛細管∞♣電(diàn)泳進行(xíng)詳細表征的(de)需求變得(de)更₹ α加緊迫。最近(jìn)，亞2μm微(wē'÷∑∏i)粒和(hé)核殼大(dà)孔徑顆粒以及一(yī)些(§<€xiē)創新的(de)離(lí)子(zǐ)交換₩€¥≠和(hé)尺寸排阻等材料也(yě)被證明(míng)可(kě  β•)以有(yǒu)效的(de)分(fēn)離(lí)這(zhè)些(xiē)ε☆∞大(dà)分(fēn)子(zǐ)的(de)生(shēng)←≈>物(wù)制(zhì)劑。

　　高(gāo)分(fēn)辨率質譜(HRMS)，電(diàn)霧式檢測±←♣器(qì)(CAD)和(hé)自(zì)動方法​λ開(kāi)發系統(AMDS)

　　在過去(qù)十年(nián)中，其他(tā)具有(yǒu)高(gā¶← →o)影(yǐng)響力的(de)進展主要(yào←&÷÷)體(tǐ)現(xiàn)在HPLC檢測和(hé)自(zì)動化☆π(huà)領域。

　　高(gāo)分(fēn)辨率質譜(HRMS)

　　HPLC與質譜的(de)聯用(yòng)(LC / MS)，集合了(le₽σ¶)HPLC的(de)分(fēn)離(lí)能(néng)力和(hσ★✘é)質譜卓越的(de)靈敏度和(hé)選擇性，已被視(shì)★♥♠為(wèi)完美(měi)的(de)分(fēn)析工(gōng)具。LC/MS←←是(shì)雜(zá)質和(hé)降解鑒定,藥物(wΩ€ù)研究中的(de)高(gāo)通(tōng)量篩選技(jì)術(s<↑¥✔hù)(HTS),生(shēng)物(wù)分(§≤÷​fēn)析試驗(生(shēng)物(wù)流體(>π≥&tǐ)中藥物(wù)和(hé)代謝(xiè)物(wù)的¥€&®(de)LC/MS/MS檢測),藥物(wù)合成工(gōn→ €g)藝放(fàng)大(dà)在線監測的(de)≤§首選技(jì)術(shù)。LC/MS已經成為(♠™♦ wèi)高(gāo)效藥物(wù)清潔驗證以及潛在的(de)基因毒性雜(zá) ₽©×質測定的(de)标準技(jì)術(shù)平台。過去(qù)十年(n ♥π"ián)中，HRMS(如(rú)TOF、OrbiTr§♦₩✘ap MS)和(hé)雜(zá)化(huà)質譜(如(rú)Quadrupoσ​le-TOF或ion trap-Orbi♠•♠Trap)得(de)到(dào)了(le)快"®↔∞(kuài)速發展。HRMS和(hé)UHPLC以及二維LC的(de)<§☆聯用(yòng)使得(de)代謝(xiè)組學、蛋白(bái)質組學, Deελ£ Novo蛋白(bái)測序和(hé)生(shē§<←ng)物(wù)制(zhì)藥表征等領域$"的(de)研究愈發活躍。新興的(de)個(gè)₽↕↓φ性化(huà)醫(yī)療領域中生(shēng)物(wù)≈∏δ 标志(zhì)物(wù)測定和(hé)疾病診斷的(de)通(tōng)用(≤≥yòng)技(jì)術(shù)平台也(yě)許是(shìφ÷)LC/MS最令人(rén)興奮的(de)機(jī)會(huì)。

　　電(diàn)霧式檢測器(qì)(CAD)

　　缺乏理(lǐ)想的(de)通(tōng)用(yò✘πng)檢測器(qì)常常被視(shì)為(wèi)HPLC的(de)局限¶¥™β,盡管UV/Vis檢測器(qì)可(kě)以檢測具有(yǒu)發色基÷α團的(de)化(huà)合物(wù)。示差折光(guā£$×&ng)檢測器(qì)不(bù)适合梯度洗脫，敏<•感性不(bù)夠。蒸發光(guāng)散射檢測器(qì↑≈§)(ELSD)使用(yòng)噴霧器(qì)技(jì)術(shù)與激光(φ©♠guāng)光(guāng)散射檢測，是(shì)HPLCπφ&的(de)一(yī)個(gè)選擇，也(yě)可(kě)以兼容梯度§÷>×洗脫,但(dàn)最近(jìn)已經被CAD(使用(yòng)噴霧器(qπ•αì)和(hé)電(diàn)暈放(fàng)電(diàn)檢測技(jì&♠©)術(shù))超越,CAD可(kě)以提供更好β×±¶(hǎo)的(de)靈敏度(低(dī)至ng)和(hé)更好(hǎ ‌o)的(de)線性。CAD正逐漸成為(wèi)藥物(wù)化(huà)學中的≥ ♥♥(de)HTS、反應過程監控以及原材料/輔料測試的(de)主ε​流的(de)檢測器(qì)。

　　自(zì)動化(huà)HPLC方法體(tǐ)系(AMDS)

　　複雜(zá)混合物(wù)的(de)HPLC方法開(kāi)發是(shì∑γσ$)一(yī)個(gè)很(hěn)耗時(shí)的(de✘σ)工(gōng)作(zuò)，因為(wèi) ₹'₩需要(yào)優化(huà)很(hěn)多(duō)操作(zu©♠ ò)參數(shù)(柱尺寸，鍵合固定相(xiàng)和(hé)流動相φ™∑(xiàng)A和(hé)B(有(yǒu)機(j   ↕ī)溶劑/緩沖類型、pH值和(hé)離(l&&✘í)子(zǐ)強度)的(de)類型,梯度洗脫時(shí)間(jiā¥εn)和(hé)梯度範圍,柱溫度、流量)。一('σ↕yī)個(gè)常見(jiàn)的(de)例子(zǐ)就(jiù)是(shì)✘®γ藥物(wù)活性成分(fēn)(API)穩定性指"≠示分(fēn)析或純度測定，其中所有(yǒu)的β→(de)雜(zá)質和(hé)降解産物(wù)必須α✘分(fēn)離(lí)，通(tōng)過UV檢測器(qì)進行(x÷δδíng)準确的(de)定量。多(duō)年(nián)≤✔以來(lái)，基于模拟、預測、單純形優化(h•™€≠uà)、柱/流動相(xiàng)篩選的(∑↑φde)軟件(jiàn)或自(zì)動化(hu♦≤<à)系統已經促進HPLC方法的(de)開φ¶''(kāi)發。雖然他(tā)們似乎還(hái)沒 δ有(yǒu)很(hěn)普及，但(dàn)持續的(de)改♠  進提高(gāo)了(le)HPLC的(de)性能(néng)和(hé)易Ω"₽用(yòng)性。最新進入市(shì)場(chǎng)的(de)是(shì★↕α)一(yī)個(gè)附加軟件(jiàn)包，≠Ωδ¶兼容兩個(gè)常用(yòng)的(de)色譜數(shù)據系βδ← 統。對(duì)于HPLC方法開(kāi)發過程(優™≈™★化(huà))中最耗時(shí)的(de)部分(fēn)，該軟↔≠¥₽件(jiàn)利用(yòng)用(yòn↑♠®g)戶定義空(kōng)間(jiān)的(d✔¶÷✘e)自(zì)動化(huà)序列方法來(lái)解決， ÷∏★其中使用(yòng)了(le)實驗設計(jì)(DoE)≠→和(hé)質量源于設計(jì)(QbD)的(de)原則。導入完>♠整的(de)序列結果之後，該軟件(jiàn)還(hái)可(kě)以執行(x±€↕<íng)統計(jì)分(fēn)析，并顯示最佳條件(jiàn)。圖5"σ 說(shuō)明(míng)了(le)應用(yòng)在我們φ∏'實驗室的(de)該軟件(jiàn)的(de)概念和(hé)特征。自(✔☆zì)DoE 和(hé) QbD概念被接受以來(lái),最初用(y♠×♥©òng)戶表現(xiàn)出很(hěn)高(gāoΩπ)的(de)興趣。AMDS對(duì)緻力于早期藥物(wù←&)開(kāi)發方法的(de)實驗室特别有(y ∞÷ǒu)用(yòng)。例如(rú),為(wèi)了(le>β)支持利用(yòng)多(duō)手性中心的(de)複" 雜(zá)藥物(wù)分(fēn)子(zǐ)進行(xíng)A₩✘≈PI合成和(hé)藥物(wù)産品制(zhì)造,10 ¶-20種具有(yǒu)代表性的(de)HPLC方法(原材料、起始物(wù¥←ε×)料、中間(jiān)體(tǐ)、最終的(de)原料藥和(£♦hé)藥物(wù)産品的(de)非手性和(hé)手性方法,)接二連三地(dì↑•φ)被開(kāi)發出來(lái)。

　　圖5 一(yī)個(gè)全自(zì)動方法開(k↕<∏ āi)發系統的(de)儀器(qì)構造圖解，該系統使用(yòng)QbD軟件↔→×☆(jiàn)和(hé)所得(de)結果的(de)圖形，顯示最佳分(fēn)離(≠π<∏lí)(白(bái)色)的(de)操作(zuò)Ω↕範圍設計(jì)空(kōng)間(jiān)。

　　結論

　　總之, 最近(jìn)幾年(nián)中，HPLC仍 §然是(shì)一(yī)個(gè)高(gāo)度有(yǒu)活÷∞β✘力的(de)領域，在儀器(qì)、色譜柱技(jì)術(shù)、應用(yòng≈§ )等方面有(yǒu)很(hěn)多(duō)創新。醫(yī)藥科(kēε©σ)學家(jiā)們最初将這(zhè)些(₩§xiē)新技(jì)術(shù)應用(yòng)于研究、開←←←♥(kāi)發和(hé)質量控制(zhì)，他(tā)們是(shì)這(&™∞∏zhè)項技(jì)術(shù)的(de γ¶✘)早期采納者，同時(shí)也(yě)是(sh✔®ì)受益者。UHPLC在研究與開(kāi)發領域被£≠δ©快(kuài)速的(de)接受，并逐漸成為(wèi)标準的(d≥§←©e)UHPLC平台，雖然在QC實驗室的(de)應用(yòng)速度€Ω♣γ慢(màn)一(yī)些(xiē)。新的(d£₹e)色譜柱技(jì)術(shù)可(kě)以更快(kuài)和δ↓≤(hé)更有(yǒu)效的(de)分(fēn)析複雜(™™‌​zá)樣品、手性分(fēn)子(zǐ)和(hé)生(β ™shēng)物(wù)分(fēn)子(zǐ)。最¶®←後,UHPLC和(hé)2-D LC與高(gāo)分(f☆©≤₩ēn)辨率質譜聯用(yòng)技(jì)術(shù×♣↑δ)的(de)快(kuài)速進展，已經徹底改變了(le)生(shēng)命科αβ(kē)學的(de)研究，并将會(huì)在  ₩臨床診斷方面産生(shēng)更大(dàσ¥)的(de)影(yǐng)響。這(zhè)些(→σ≥xiē)進展得(de)到(dào)了(le)在快(kuài λ)速發展的(de)藥物(wù)開(kāi)發領φ∑&♥域工(gōng)作(zuò)的(de)分(fēn)析化↕¥(huà)學家(jiā)的(de)歡迎。

　　對(duì)于LC在接下(xià)來(lái)的(de)₽≥₩幾年(nián)的(de)發展前景,一(yī♠✔)些(xiē)創新的(de)工(gōng)作(↔©γzuò)已經被描述。就(jiù)像Jim Jorge↔®☆≠nson描述的(de):“更高(gāo)的(de§™<)壓力(50000 psi)将使更小(xiǎo)的(de)顆粒和(hé)/∑ Ω或更長(cháng)的(de)色譜柱的(de)使♣•用(yòng)成為(wèi)可(kě)能(néng),同時(shí)分 ©±(fēn)離(lí)速度更快(kuài)，效果也(yě)¶₹∏更好(hǎo)。由于熱(rè)量的(de)産生(shēng)和(hé)γφ耗散問(wèn)題，幾乎肯定的(de)是(shì)需要(yào)使α'用(yòng)sub-mm孔(毛細管)色譜柱。這(zhè)并不(bù)©©≠‌是(shì)一(yī)件(jiàn)容易的(de)事(shì∏≤↕)情,但(dàn)是(shì)高(gāo'α☆♦)速、高(gāo)分(fēn)辨率分(fēn)離(lí)方面潛在的(d∏↕≤e)可(kě)能(néng)性是(shì)誘™∞¥人(rén)的(de)。”另α✘外(wài),在毛細管中填充極其均一(yī™∑)的(de)次微(wēi)米二氧化(huà↔')矽粒子(zǐ)可(kě)以用(yòng)來(lái)産生(shēng)遠★σ✔(yuǎn)低(dī)于1μm的(de)塔闆高(gā←α‌o)度，并能(néng)對(duì)蛋白(bái)質變異體(tǐ)進行(☆←™₩xíng)令人(rén)印象深刻的(de)分(fα♥♠♠ēn)離(lí)。這(zhè)兩個(gè)研究結果還(há✘↑→i)沒有(yǒu)準備好(hǎo)馬上(shàng)成為(wèi)主流分(≈→φ$fēn)析工(gōng)作(zuò)或QC，但(dàn)是(shì♦ε↕ )第一(yī)個(gè)結果是(shì)鼓舞(wǔ)人(rén)心的(de)♣↓α€,因此在這(zhè)裡(lǐ)值得(de)一(yī)提。

原文(wén)作(zuò)者：Michael W. Dong, Ph.D.<γ€

Davy Guillarme, Ph.D.