污染是(shì)細胞培養的(de)大(dà)敵。預防  和(hé)避免污染是(shì)細胞培養成功的(de)關鍵之一(yī)。一©∏"(yī)開(kāi)始就(jiù)要(yào)φ₹十分(fēn)重視(shì)，防止污染，否則會(huì)前≈≥↓≈功盡棄，不(bù)僅浪費(fèi)時(shí)間(jiān)，而•≈且浪費(fèi)人(rén)力、物(wù)力，甚至造成無法彌補的(de)損失>"。

　　(一(yī))污染的(de)類型

　　細胞培養過程中的(de)污染不(bù)僅僅指微(wēi)生©‍≠♦(shēng)物(wù)，而且還(hái)包括™€所有(yǒu)混入培養環境中的(de)、對>'(duì)細胞生(shēng)存有(yǒu)害或造成細胞不(bù)純的(de☆"π₹)物(wù)質，包括生(shēng)物(wù)和(hé)化(huà)€β"學物(wù)質。

　　1、細菌污染

　　細菌污染是(shì)實驗室細胞培養中常見(jiàn)的(✔λde)污染，即使在細胞培養液中加入了(le)抗菌素，也(yě¥±)可(kě)能(néng)因為(wèi)操作(zuò)不∞★÷→(bù)慎而引起污染。最常見(jiàn)的(de)有€±≈(yǒu)革蘭氏陽性菌，如(rú)枯草(cǎo)杆菌以及大(dà)腸杆菌、假單∑ 胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又(yòu)以白(bái)色葡萄​↓≈‍球菌較常見(jiàn)。

　　培養細胞受細菌污染後，會(huì)出現(xiàn‍γ)培養液變混濁，pH改變。污染後細胞發生(shēng)病理(l​≥≈'ǐ)改變，胞內(nèi)顆粒增多(duō)、增粗，最後變圓脫落死亡≈δ£。

　　2、真菌污染

　　真菌污染是(shì)細胞培養過程中最常見(jiàn)的(de)一♣♦‍(yī)種，最常見(jiàn)的(de)真菌有(yǒu)煙(y§&ān)曲黴、黑(hēi)曲菌、孔子(zǐ)λ‌₩黴、毛黴菌、白(bái)色念珠菌和(hé)酵母菌。

　　培養細胞受真菌污染後，可(kě)見(ji∏$àn)培養液中漂浮著(zhe)白(bái)色或淺黃(huáng)>≈§λ色的(de)小(xiǎo)點，有(yǒu)的(de)散在生(shēng)長(‌×"cháng)，培養液一(yī)般不(bù)發生(shēngΩ☆)混濁;倒置顯微(wēi)鏡下(xià)可(kě)見(jiàn)絲狀、管狀$±或樹(shù)枝狀的(de)菌絲縱橫交錯('←∞λcuò)在細胞之間(jiān)或培養基中，有(yǒu)的(de)呈鏈狀排 ↔Ω≈列。

　　真菌污染後，細胞生(shēng)長(ch≤←áng)變慢(màn)，但(dàn)最後由于營養耗盡及毒性作(zuòσ ¥™)用(yòng)而使細胞脫落死亡。

　　

絲狀菌污染

　　3、支原體(tǐ)污染

　　支原體(tǐ)是(shì)介于細菌與病毒之間(jiān)♠£≤能(néng)獨立生(shēng)活的(de)最小(xiǎo)微(w∑≠↓∞ēi)生(shēng)物(wù)，最小(xiβ€>ǎo)直徑0.2μm，一(yī)般過濾除菌無法去(qù)除它，±♣∑$光(guāng)鏡下(xià)難以看(kàn)清它的(de)形态結構。開(kā€•i)始不(bù)易發現(xiàn)，能(néng) δ∞在偏堿條件(jiàn)下(xià)生(shēn← ₩πg)存，對(duì)青黴素有(yǒu)抗藥性。多(duō)吸附于細胞表面或™↓散在于細胞之間(jiān)。

　　培養細胞受支原體(tǐ)污染後，部分(fēn)敏感細胞可(k♥≠ ě)見(jiàn)細胞生(shēng)長(ch¶↑£áng)增殖變慢(màn)，部分(fēn)細胞變圓，從(c₹ ±→óng)瓶壁脫落。但(dàn)多(duō×¥€)數(shù)細胞污染後無明(míng)顯變化(huà)，或略有(y₹ ǒu)變化(huà)，若不(bù)及時(shí)處理(lǐ)，還(hái)♠ Ω會(huì)産生(shēng)交叉污染。

    

陽性   &nbs→∏¥p;      ®&©®;   &nbs• ♣♣p;   &nbπ↕‌←sp;  陰性

　　4、病毒污染

　　組織細胞培養過程中，如(rú)果沒有(yǒu)除去(qù€↓)潛在的(de)病毒，就(jiù)會(huì)産生(shēnλδ•₽g)病毒污染。目前，從(cóng)原代猴腎細胞的(de)培養中已發現(φ​•xiàn)不(bù)少(shǎo)于20種血清性病毒。€ →

　　盡管病毒污染的(de)細胞不(bù)影(yǐng)響原代培養，但(dà<↔≥♥n)生(shēng)産疫苗是(shì)不π→(bù)安全的(de)。因此，潛在病毒是↔‍(shì)細胞大(dà)量生(shēng)産和(hé)疫苗、幹擾素等生→÷≠(shēng)物(wù)制(zhì)品制(zh±≈ì)作(zuò)中的(de)難題。

　　5、非同種細胞污染

　　由于細胞培養操作(zuò)時(shí)各細胞株☆↓所需的(de)器(qì)材和(hé)溶液沒有(yǒu)嚴♣£€格分(fēn)開(kāi)，往往會(huì)使一(yī ↓®∞)種細胞被另一(yī)種細胞污染。目前，世界上(shàng)已有(yǒu)♣∞₽β幾十種細胞都(dōu)被HeLa細胞所污染，緻使許多(duō)實驗宣告無效。

　　非細胞培養物(wù)所造成的(de)化(huà)學成分(∏ε✔fēn)的(de)污染也(yě)偶有(yǒu)發生(shēng)，大(dà‌≠)多(duō)是(shì)由于細胞培養所需物(w  ù)品清洗消毒不(bù)徹底而帶入一(yī)些(xiē)有(yǒu)毒化(£₹huà)學物(wù)質所緻。

　　(二)污染的(de)鑒别

　　1、細菌、真菌污染的(de)檢測

　　(1)肉眼觀察

　　細菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開(kāi)放(fàng)性操作£♣¥☆(zuò)之後發生(shēng)，而且增生(shē≠♣¥ng)迅速，若有(yǒu)污染，在48小(xiǎo)時(shí)內(∞₽'nèi)可(kě)明(míng)顯觀察到(dào)，例如(rú)培®‍>養液變混濁，或略加振蕩有(yǒu)很(hěn)多(duō)漂浮物(wù)漂起♣×★↕。

　　(2)接種觀察

　　采用(yòng)普通(tōng)肉湯接種或用(yòng)£"未加雙抗藥物(wù)的(de)培養液接種，也(yě)可(kě)發→ π≥現(xiàn)是(shì)否有(yǒu)污染。

　　(3)鏡下(xià)觀察

　　在倒置顯微(wēi)鏡的(de)高(gāo)倍鏡下(xià)可​☆(kě)見(jiàn)培養液中有(yǒu)大(dà)量圓球$α‍β狀顆粒漂浮，即為(wèi)細菌污染。

　　若細胞之間(jiān)有(yǒu)絲狀、管狀、樹(shù)枝狀或卵形的‌♥ (de)物(wù)質常為(wèi)真菌污染。

　　2、支原體(tǐ)污染的(de)檢測

　　(1)相(xiàng)差顯微(wēi)鏡觀察

　　直接取少(shǎo)許培養液滴在載物(wù•✘↕)片上(shàng)，再蓋上(shàng)蓋片觀察，支原體(tǐ)在鏡下(xiδΩπΩà)呈暗(àn)色微(wēi)小(xiǎo)顆粒，多(duō)位于細胞與細•≠$★胞之間(jiān)，有(yǒu)時(shí)可(kě)見♥©(jiàn)類似于布朗運動的(de)表現(xiàn)。®Ω應注意與細胞破碎溢出的(de)內(nèi)容物(wù)如↔€β(rú)線粒體(tǐ)等相(xiàng)區(qū)别。

　　(2)熒光(guāng)染色法觀察

　　用(yòng)熒光(guāng)染料Hoec↕‍hst33258，此染料能(néng)與DNA特異地(dì)∑☆結合，可(kě)使支原體(tǐ)內(nèi)的(de)DNA著(zhe÷✘)色，熒光(guāng)顯微(wēi)鏡下(xià)支原✘δ✘♥體(tǐ)呈綠(lǜ)色小(xiǎo)點，£∞¥Ω散在于細胞周圍或附于細胞表面。

　　(3)電(diàn)鏡檢測

　　若條件(jiàn)許可(kě)，可∑&(kě)用(yòng)掃描電(diàn)鏡或透射電(di₩>àn)鏡觀察。一(yī)般在細胞培養48～72小(xiǎo)時≈ επ(shí)，細胞接近(jìn)彙合前，用(yòng)胰酶消化(huà)細 >胞制(zhì)成細胞懸液後進行(xíng)固定、包埋、切片後才能(néng)↕&進行(xíng)觀察。

　　

支原體(tǐ)掃描電(diàn)鏡圖片

　　(4)培養檢測

　　将細胞懸液5mL加入45mL支原體(tǐ)肉湯培←×γ養基，培養14天後觀察肉湯培養有(yǒu)無霧狀沉澱，然後取0.5mφ÷'€l加入已冷(lěng)卻到(dào)50℃的(de)培↑€≈₹養基中，再用(yòng)瓊脂培養基做(zuò)分(​↕fēn)離(lí)培養，37℃培養3天觀察有(y♣ ǒu)無“荷包蛋”菌落出現(x♣​iàn)。

　　3 、病毒的(de)檢測

　　1) 應用(yòng)電(diàn)鏡技(jì)術(shù) "÷λ快(kuài)速診斷動物(wù)病毒病

　　

冠狀病毒電(diàn)鏡圖

　　2) 逆轉錄_聚合酶鏈反應RT_PCR£‌γ檢測病毒

　　(三)污染的(de)清除

　　培養細胞一(yī)經污染，多(duō)數(shù)∑↔‌較難處理(lǐ)。如(rú)果污染細胞價值不(bù)大(dà)，宜棄₽®§之;在尋找原因後徹底消毒操作(zuò)室，複蘇或重新購 ₹±(gòu)置細胞，再培養。

　　若污染細胞價值較大(dà)，又(yòu)難于重新得(de>→)到(dào)，可(kě)采取以下(xià)辦法清除。

　　一(yī)、細菌和(hé)真菌的(de)清除

　　1、使用(yòng)抗生(shēng)素

　　抗生(shēng)素對(duì)殺滅細菌較有(yǒu)效。聯合用(yλ×♠←òng)藥比單獨用(yòng)藥效果好(hǎo)。預≥±≠♠防用(yòng)藥比污染後再用(yòng)藥效果好(hǎo)。預防用(yòn←©$g)藥一(yī)般用(yòng)雙抗生(shē®☆'ng)素，污染後清除用(yòng)藥需采用(×↔εyòng)大(dà)于常用(yòng)量5～10倍的(de)沖洗法，于↕✘加藥後作(zuò)用(yòng)24～48小(xiφβ♣≤ǎo)時(shí)，再換常規培養液。此法在污染早期σπ 有(yǒu)效。

　　二、支原體(tǐ)的(de)清除

　　1、用(yòng)MRA處理(lǐ)

　　用(yòng)MRA(Mycoplasma Rem≈♥♦oval Agent)處理(lǐ)細胞，每4天換一(yī)次液,連續♦±↓處理(lǐ)15天以确保細胞純潔健康，效果好(hǎo).

　　2、用(yòng)清洗純化(huà)法清除支原體(tǐ)♦‍σ污染的(de)方法

　　細胞營養馴化(huà)→優質細胞群的(de)篩選&≥ ''rarr;細胞清洗→反複離(lí)心洗滌

　　其原理(lǐ)是(shì)利用(yòng)離(lí)心力、<↑↓細胞、微(wēi)生(shēng)物(wù)質量和( ✘↔&hé)懸液的(de)浮力差達到(dào)清除σ 支原體(tǐ)的(de)目的(de)。由于支原體(tǐ)個(gè)體(tǐ)‍₽•小(xiǎo)且除發酵支原體(tǐ)外(wài)多(duō)為(wèi)細胞®‍‍外(wài)寄生(shēng),所以通(tōng)過反複洗滌細胞和(hé)低(∞&dī)速離(lí)心換液使其中潛在的(de)支原體(tǐ)數(shù£÷φ)量降低(dī)至極限。

　　如(rú)結合敏感抗生(shēng)素的(de)抑λ¥™♥殺作(zuò)用(yòng)，可(kě)達到(dào)更好(hγ♥§∞ǎo)的(de)效果。

　　3、藥物(wù)輔助加溫處理(lǐ)

　　先用(yòng)藥物(wù)處理(lǐ)後，再将污染的(de)組織培☆↔養物(wù)放(fàng)在41℃培養18小(xiǎo)時(shí)，可(​÷γ¥kě)殺死支原體(tǐ)，但(dàn)對(duì)細胞有(yǒu)™ 不(bù)良影(yǐng)響。

　　4、使用(yòng)支原體(tǐ)特異性↔₽≠血清

　　用(yòng)5%的(de)兔支原體(tǐ♠‌ £)免疫血清可(kě)去(qù)除支原體(tǐ)污染，因特異抗體(t$§×ǐ)可(kě)抑制(zhì)支原體(tǐ)生(shēng)長(®↑cháng)，故經抗血清處理(lǐ)後11天即轉為(wèi)陰∑®'♣性，并且5個(gè)月(yuè)後仍為(wèi)陰性。但(dàn)此法比較麻煩↕©φ，不(bù)如(rú)用(yòng)抗生(shēng)∏€÷素方便、經濟。

　　(四)、污染的(de)預防

　　預防是(shì)防止細胞培養過程中發生(shēng)污染的(₩♦£de)最好(hǎo)辦法。隻有(yǒu)預防工(gōng)作(zu∏©±ò)做(zuò)在前，才能(néng)将發生(±"shēng)污染的(de)可(kě)能(n∑♣©éng)性降到(dào)最小(xiǎo)程度。

　　一(yī)般預防可(kě)從(cóng)以下(x‍ ​ ià)幾方面著(zhe)手：

　　1、添加抗生(shēng)素

　　2、從(cóng)物(wù)品、用(yò♥↕$₹ng)品消毒滅菌著(zhe)手

　　細胞培養所用(yòng)物(wù)品清洗、消毒要(y←€ào)徹底，各種溶液滅菌除菌要(yào)仔細，并在無菌試驗陰性後才能(né≈Ω≤ ng)使用(yòng)。

　　操作(zuò)室及剩餘的(de)無菌器(qì)材要(yào)‍♣&£定期清潔消毒滅菌。

　　3、從(cóng)操作(zuò)者做(zuò)起

　　(1)進無菌室前要(yào)用(yòng)肥皂洗手，按規定穿隔離(₹¶β¶lí)衣。工(gōng)作(zuò)開(kāi)始要₽‌÷(yào)先用(yòng)75%酒精棉球擦手、擦瓶口和(hé>↔→‌)燒灼瓶口。

　　(2)操作(zuò)者動作(zuò)要(yào)輕，必須在∑★火(huǒ)焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開(kāi)瓶口，并将瓶口轉動燒♥π≥∑灼。操作(zuò)時(shí)盡量不(bù)要(yào)談話(huàε→)，若打噴嚏或咳嗽應轉向背面。

　　(3)操作(zuò)時(shí)要(yào)常更換吸∑©'管，一(yī)旦發現(xiàn)吸管口接觸了(le)手和(hé)其他(tā∞£)污染物(wù)品應棄去(qù)。實驗完畢"γ∞用(yòng)消毒水(shuǐ)浸泡的(de)紗布擦台面。

　　4、防止細胞交叉污染

　　在進行(xíng)多(duō)種細胞培養操作(zuò)時(s<β§​hí)，所用(yòng)器(qì)具要(yào)嚴格區(qū)分(fēn)。→ ☆↑

　　在進行(xíng)換液或傳代操作(zuò)時(shí)，注射器( ≤φ•qì)和(hé)滴管不(bù)要(yào)觸及細胞培養瓶©≥ 瓶口，以免把細胞帶到(dào)培養液中污染其↓ σ他(tā)細胞。

　　細胞一(yī)旦購(gòu)置或從(cóng)别處引入，均應 ☆及早留種凍存，一(yī)旦發生(shēng)污染可(kě)≥δ重新複蘇培養。

　　5、無菌室的(de)徹底消毒

　　1) 0.1%新潔爾滅全面徹底擦洗無菌室;γ÷✘

　　2)甲醛熏蒸法：甲醛是(shì)一(yī)種廣譜滅菌劑菌，其水(shuπ↕✔ǐ)溶液和(hé)氣休對(duì)各種細∞§菌、芽孢及真菌等微(wēi)生(shēng)™÷物(wù)均有(yǒu)殺滅作(zuò)用(yòng)。